Главная » 2013 » Октябрь » 28 » Скачать Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.. Фурсова, бесплатно
14:01
Скачать Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.. Фурсова, бесплатно
Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Диссертация
Автор: Фурсова, Оксана Васильевна
Название: Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Справка: Фурсова, Оксана Васильевна. Анализ функциональной организации гена, контролирующего ответ на холодовой стресс у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.15 / Фурсова Оксана Васильевна; [Место защиты: Ин-т общ. генетики им. Н.И. Вавилова РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 175 с. ил. Москва, 2009 175 c. :
Объем: 175 стр.
Информация: Москва, 2009
Содержание:
1 Введение
11 Актуальность темы
12 Цель и задачи исследования
13 Научная новизна
14 Практическая значимость работы 8 15 Список сокращений
2 Обзор литературы
21 Arabidopsis thaliana (L) Heynh как модельный объект молекулярно-генетических 14 исследований
211 Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма:
22 Первые мутанты A thaliana (L) Heynh 15 213 Геном A thaliana
22 Абиотический стресс Холодоустойчивость
23 Убиквитин-зависимый протеолиз Введение 24 231 Биохимические механизмы и особенности убиквитин-зависимого протеолиза
2321 Схема убиквитин-зависимого протеолиза
2322 Протеосома 26S
2323 Убиквитин
2324 Этапы убиквитинилирования
2325 Характеристика семейства F-бокс-содержащих генов и кодируемых ими белков 31 FBP
23251 Классификация F-бокс-содержащих белков эукариот (FBP) на основании 32 данных об их структуре
23252 F-домен
23253 Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков млекопитающих
23254 Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков A thaliana
23255 Функции эукариотических F-бокс белков FBP 35 232551 Функции FBP у растений 36 23 Регуляция на уровне экспрессии генов: Транскрипционные факторы Семейство bHLH
241 Транскрипционные факторы эукариот
242 Транскрипционные факторы A thaliana
243 Характеристика семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix-loop- 42 helix (bHLH) i
2431 История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических 42 транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH)
2432 Структура домена basic helix-loop-helix (bHLH)
2433 Классификация эукариотических белков семейства транскрипционных 45 факторов по типу basic helix-loop-helix (bHLH)
24331 Классификация по типу основного домена
24332 Классификации белков семейства транскрипционных факторов по типу bHLH
A thaliana I
2434 Функции белков семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix- 47 loop-helix (bHLH)
24341 Общие сведения
24342 Функции белков bHLH
24343 Функции белков bHLH A thaliana
25 РНК-направленное «замолкание» генов - HDGS - феномен «подавления 48 экспрессии генов с высокой степенью идентичности»
251 Введение 48 '
252 Молекулярные механизмы
253 миРНК-биогенез
2531 Регуляция активности генов посредством миРНК
2532 Функционирование миРНК
2533 миРНК-биогенез у растений
254 Особенности развития PTGS при системном транспорте у растений
255 Вирусные гены - супрессоры PTGS: HYR-зависимая РНК-полимераза RdRp
2551 История открытия
2552 Свойства РНК-зависимых РНК-полимераз у растений
256 Модель функционирования белковых комплексов, осуществляющих деградацию мРНК с помощью киРНК
257 Использование метода получения индивидуального «замолкания» гена для молекулярно-генетических исследований
3 Материалы и методы
31 Линии растений Arabidopsis thaliana (L) Heynh
32 Штаммы бактерий и плазмиды
33 Питательные среды
34 Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов
36 Методы получения компетентных клеток Е coli
361 Получение компетентных клеток Е coli, обеспечивающих трансформации 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК
362 Получение компетентных клеток Е coli, обеспечивающих трансформации 106-107 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК
363 Получение компетентных клеток Е coli, обеспечивающих трансформации до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК
37 Методы трансформации клеток Е coli
371 «Быстрая» трансформация клеток Е coli с эффективностью 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК эффективностью 10-10 колоний на 1 мкг эффективность эффективность эффективность
372 Трансформация клеток Е coli плазмидной ДНК
373 Трансформация клеток Е coli с эффективностью до 109 колоний на 1 мкг 67 плазмидной ДНК (электропорация)
374 Отбор клеток Е coli, несущих рекомбинантные плазмиды
38 Метод быстрого «переклонирования» ДНК из одного вектора в другой
39 Скрининг бактериальных колоний методом ПЦР
310 Трансформация клеток бактерий Agrobacterium tumefaciens 69 3101 Конъюгативный перенос ' 69 3102 Трансформация клеток A tumefaciens методом электропорации
311 Культивирование растений A thaliana
3111 Подготовка семян A thaliana к посеву: поверхностная стерилизация
3112 Выращивание растений в стерильных условиях на чашках Петри
3113 Выращивание растений в открытом грунте
3114 Выращивание растений в стрессовых условиях
312 Агробактериальная трансформация растений A thaliana
3121 Агробактериальная трансформация на ранней стадии развития растения — 72 стадии прорастающих семян
3122 Агробактериальная трансформация неопыленных бутонов
313 Отбор трансгенных растений A thaliana
3131 Отбор трансгенных растений A thaliana в почве (in vivo)
3132 Отбор трансгенных растений A thaliana в песке (in vivo)
3133 Отбор трансгенных растений A thaliana in vitro
314 Методы выделения геномной ДНК из тканей растений A thaliana 75 3141 Быстрое выделение ДНК из листьев A thaliana для ПЦР-тестирования на наличие инсерции Т-ДНК
3142 Получение мини-препаратов ДНК из тканей растений A thaliana
3143 Выделение ДНК A thaliana для блот-гибридизации
3144 Выделение геномной ДНК A thaliana для последующего клонирования
315 Методы выделения плазмидной ДНК из клеток бактерий
3151 Получение мини-препаратов ДНК
3152 Тепловой метод выделения ДНК
3153 Получение препаратов плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей
3154 Очистка препаратов ДНК от примесей белков
3155 Очистка препаратов ДНК от примесей РНК
3156 Хроматографическая очистка препаратов ДНК
3157 Очистка препаратов ДНК методом электроэлюции
31571 Трубчатый электрофорез
31572 Электроэлюция в диализную плёнку
3158 Очистка ДНК при помощи центрифугирования 82 3159 Концентрирование препаратов ДНК с помощью изо-бутанолового спирта
316 Метод амплификации ДНК для последующего клонирования
317 Клонирование фрагментов ДНК
318 Метод блот-гибридизации по Саузерну
319 Анализ мРНК в растительных тканях A thaliana
3191 Реакция обратной транскрипции с поли-Т праймером
3192 Реакция обратной транскрипции с гексапраймерами
320 Количественный ПЦР в реальном времени (qPCR)
321 Секвенирование ДНК
322 Праймеры, использованные в работе
323 Определение углеводной и липидной составляющей в семенах трансгенных 88 линий с помощью ЯМР
4 Результаты и обсуждение
41 Предпосылки Инсерционная мутантная линия №137 89 i 411 Локализация инсерции в гене Atlgl2860 трансгенной линии A thaliana № 137
42 Анализ экспрессии гена Atlgl
43 Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по 97 нуклеотидному составу
431 Сравнительный анализ генов со значимой степенью соответствия первой части 99 гена Atlgl2860
4311 Анализ мутантного фенотипа мутантной линии A thaliana, содержащей 101 инсерцию в гене Atlgl3200 I
432 Сравнительный анализ гена со значимой степенью соответствия второй части 102 TQRaAtlgl2860
43 Получение трансгенных линий Athaliana характеризующихся измененной 106 экспрессией гена Atlgl2860
431 Создание векторных конструкций для получения трансгенных линий Athaliana, 106 характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией первой и второй частей TenaAtlgl2860 независимо
4311 ЭТАП 1 Амплификация нуклеотидных последовательностей двух частей гена 108 i Atlgl2860
4312 ЭТАПЫ 2-4 Клонирование двух частей гена Atlgl
432 Создание векторной конструкции для получения трансгенных линий Athaliana, 113 характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией полноразмерной копии гена Atlgl2860
4321 Клонирование полноразмерной копии гена Atlgl
44 Вектор для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl2860
441 Амплификация уникального фрагмента для РНК-направленного «замолкания» 120 гена Atlgl
442 Клонирование уникальных фрагментов со второго экзона гена Atlgl2860
45 Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с помощью векторов, 124 специально созданных для определения тонкой структурно-функциональной организации и функции гена Atlgl2860
46 Анализ мРНК гена Atlgl2860 в трансгенных линиях с измененной экспрессией 126 гена Atlgl2860
461 Поиск альтернативных форм сплайсирования гена Atlgl2860
462 Анализ in silico предполагаемой функции продукта гена At5g61270 132 48 Поиск мутантного фенотипа трансгенных линий A thaliana, характеризующихся 133 измененной экспрессией гена Atlgl2860
481 Анализ развития трансгенных растений A thaliana, характеризующихся 133 измененной экспрессией TenaAtlgl2860, в стрессовых условиях
410 Сравнение содержания липидов и углеводов в семенах трансгенных растений по сравнению с растениями дикого типа
Введение:
1.1. Актуальность темы.
Изучение функций генов у различных организмов до сих пор остаётся одной из наиболее важных и необходимых целей научных исследований. Анализ полученных данных может дать информацию и для сравнительной генетики и для глобального понимания процессов на всех уровнях развития. При изучении функций генов используются методы как прямой, так и обратной генетики. В случае использования подходов обратной генетики проводится отбор кандидатных генов по нуклеотидному составу, схожести последовательностей их белковых продуктов, временному промежутку экспрессии и другим параметрам. Для определения функций генов высших растений основным является метод инсерционного мутагенеза. Основной задачей инсерционного мутагенеза является создание разных типов мутантов, с помощью которых можно наиболее полно охарактеризовать гены и процессы, функция которых каким-либо образом изменена.
Геном растений, и геном A. thaliana в частности, содержит большое число межгенных участков, при попадании в которые инсерция не затрагивает участки, значимые для транскрипции генов. На основании этого факта можно анализировать «суперэкспрессирующие» трансгенные линии и трансгенные растения с РНК-направленным «замолканием» конкретных генов, при встраивании инсерции в данные участки. После завершения в 2000 году глобального проекта по определению нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana, при помощи компьютерных программ in silico было определено множество рамок считывания, предсказаны гены, их структура и функции. Но, несмотря на проделанную биоинформатическую работу, этап экспериментальной проверки полученных данных до сих пор не закончен. Таким образом, экспериментальный анализ структурно-функциональной организации генов, и в частности, поиск и идентификация генов растений, вовлеченных в регуляцию ответа на биотические и абиотические стрессы, на данный момент является актуальной задачей.
В связи с необходимостью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, устойчивость к холодовому стрессу у растений становится одной важнейших задач для генетики и функциональной геномики растений. Ранее были изучены и локализованы гены, такие как ICE1, ESK1 и другие, которые участвуют в регуляции ответа на холодовой стресс. Однако повышенная экспрессия этих генов не приводит сохранению жизнеспособности растений при сильных заморозках. Таким образом, остается актуальной задача идентификации новых генов, участвующих в ответе на холодовой стресс и обеспечивающих морозоустойчивость растений.
