Главная » 2013 » Ноябрь » 24 » Скачать Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков. Басова, Лиана Владимировна бесплатно
17:02
Скачать Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков. Басова, Лиана Владимировна бесплатно
Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков
Диссертация
Автор: Басова, Лиана Владимировна
Название: Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков
Справка: Басова, Лиана Владимировна. Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.02 Пущино, 2004 126 c. : 61 04-3/1461
Объем: 126 стр.
Информация: Пущино, 2004
Содержание:
Список использованных сокращений и обозначений
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
11 Ненативные состояния белков в живой клетке
12 Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент in vivo
13 Белки и мембраны Возможные пути взаимодействия
14 Водно-спиртовые смеси как модель влияния поля мембраны на структуру белков
15 Пространственная структура и функции миоглобина
16 Структура и свойства цитохрома Ьз
17 Краткая характеристика структуры а-лактальбумина
18 Заключение
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Приготовление растворов
22 Методы исследования третичной структуры
221 Абсорбционная спектроскопия
222 Флуоресцентная спектроскопия
223 Круговой дихроизм в ближней УФ области
224 Спектроскопия ЯМР высокого разрешения
225 Сканирующая микрокалориметрия
23 Методы изучения вторичной структуры
231 Круговой дихроизм в дальней УФ области
24 Методы исследования взаимодействия белков с мембраной
241 Высокоэффективная жидкостная гель-хроматография
242 Макроскопическая диффузия
243 Ограниченный протеолиз РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ МИОГЛОБИНА
31 Фосфолипидные везикулы вызывают нарушение третичной структуры миоглобина
32 Вторичная структура миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул сохраняется
33 Денатурация миоглобина, вызываемая фосфолипидными везикулами, приводит к взаимодействию белка с их поверхностью
34 Стабильность миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул
35 Фосфолипидные везикулы облегчают автоокисление оксимиоглобина
ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМОГО ФРАГМЕНТА ЦИТОХРОМАЬз
41 Особенности нарушения нативных взаимодействий в третичной структуре цитохрома Ьз в присутствии фосфолипидных везикул
42 Сохранение вторичной структуры цитохрома Ьз в присутствии фосфолипидных везикул
43 Взаимодействие цитохрома Ъ^ с фосфолипидными везикулами
44 Денатурирующее действие везикул из смеси фосфолипидов на цитохром Ьз эффективнее, чем из ненасыщенных отрицательно заряженных фосфолипидов
ГЛАВА 5 СОПОСТАВЛЕНИЕ КОНФОРМАЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ В ПРИСУТСТВИИ ВЕЗИКУЛ И В ВОДНО-СПИРТОВЫХ СМЕСЯХ
51 Конформационные изменения а-лактальбумина в присутствии фосфолипидных везикул
52 Сопоставление структурных особенностей различных белков в присутствии фосфолипидных везикул
53 Сравнительная оценка конформационного состояния различных белков в присутствии фосфолипидных везикул и в водноспиртовых смесях
Введение:
Актуальность проблемы. В последние годы генетические заболевания человека, связанные с дефектами в сворачивании белков или их агрегацией, привлекают пристальное внимание ученых. Было показано, что в эти процессы вовлекаются промежуточные состояния различных белков, не имеющих жесткой нативной структуры и способных адаптироваться к различным условиям в клетке. Поэтому, выяснение причин, приводящих к возникновению ненативных промежуточных состояний белков в клетке, является своевременным и актуальным на современном этапе. Изучение условий, приводящих к конформационным изменениям в белках, может помочь в поиске решения для устранения дефектов в сворачивании белков и образования агрегатов. Сюда же примыкают и проблемы выяснения механизмов белок-белковых взаимодействий, транслокации белков через мембраны, деградации белков в лизосомах, обмена лигандами (см. обзор Bychkova & Ptitsyn, 1993). Ранее нами было предположено, что наряду с такими естественными денатурирующими факторами, как пониженное рН в ряде органелл и возникновение тепловых, солевых и других стрессов, отрицательно заряженная мембранная поверхность может служить умеренно денатурирующим агентом в клетке, благодаря усилению электростатических взаимодействий на границе раздела водной и неполярной фаз.Представляемая работа посвящена выяснению особенностей воздействия отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние белков, функционирующих в ее непосредственной близости.Проведено изучение структурных изменений, которые могут произойти с нативными белками, имеющими различный суммарный заряд, вблизи мембраны при нейтральных значениях рН. Ранее были опубликованы работы по исследованию взаимодействия белков с мембранами, но в условиях, когда белки уже находились в промежуточном состоянии типа расплавленной глобулы или при функционировании должны с ней связываться.Цель и задачи исследования. Основной целью исследования является изучение влияния отрицательно заряженной мембраны на конформационное состояние глобулярных белков при нейтральных значениях рН. В задачи исследования входило: 1) охарактеризовать третичную и вторичную структуру слабо положительно заряженных апо- и холомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ьз в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул; 2) изучить взаимодействие с мембраной белков, имеющих различный суммарный заряд; 3) сравнить структурные изменения белков в присутствии фосфолипидных везикул и в условиях, моделирующих ближайшее окружение мембраны (в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН).Научная новизна работы. Впервые проведено исследование влияния отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние водорастворимых глобулярных белков при нейтральных рН. При нейтральных рН раствора в отсутствие мембран все исследованные белки имеют нативную конформацию с жесткой третичной структурой. Показано, что в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул слабо положительно заряженные холо- и апомиоглобины, а также отрицательно заряженный водорастворимый домен цитохрома bs даже при нейтральных рН претерпевают переход из нативного состояния в промежуточное, которое имеет свойства, сходные с расплавленной глобулой, описанной для различных белков в водных условиях, но не идентично ему. Полученное нами промежуточное состояние характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры при сохранении ярко выраженной вторичной структуры. Для разрушения третичной структуры каждого исследуемого белка требуется определенная концентрация фосфолипидов, зависящая от суммарного заряда и структурной организации белка. В промежуточном состоянии, возникающем под влиянием мембранной поверхности, все исследованные белки связываются с мембраной благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Флуктуирующая структура белков в непосредственной близости от мембранной поверхности может быть необходима для выполнения их функции. В случае миоглобина это может способствовать более легкому отщеплению кислорода и обмену с другими лигандами, а в случае водорастворимого фрагмента цитохрома Ьз облегчению его взаимодействия с белками-партнерами при переносе электрона.Сопоставление конформационного поведения белков в присутствии мембран и в модельных условиях показало, что основные черты воздействия мембранной поверхности на белки хорошо воспроизводятся в водноспиртовых смесях при умеренно низких значениях рН. Это подтверждает гипотезу о способе воздействия мембран на белки, связанную с усилением электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности.Диссертационная работа состоит из "Введения", пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Во "Введении" представлено описание актуальности изучаемой проблемы и цели исследования, а также отражена научная новизна работы. Глава 1 посвящена описанию и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований ненативных состояний белка в клетке и полученных в модельных системах. В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в данной работе. В главе 3 представлено экспериментальное исследование структурных свойств апо- и холомиоглобинов в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 4 описано конформационное поведение водорастворимого фрагмента цитохрома Ьз в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 5 представлены структурные данные, полученные для человеческого а-лактальбумина, а также проводится сравнительное описание конформационного состояния различных белков в присутствии везикул и в водно-спиртовых смесях. Раздел "Заключение" содержит основные итоги работы. В конце диссертации приведены основные выводы данной работы и список Цитируемой литературы в алфавитном порядке.Основные результаты данной диссертационной работы отражены в 16 публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
