| Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза
Диссертация
Автор: Котлярова, Вероника Александровна
Название: Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза
Справка: Котлярова, Вероника Александровна. Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 Москва, 2006 103 c. : 61 07-3/116
Объем: 103 стр.
Информация: Москва, 2006
Содержание:
1 СНИСОКИСНОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬНРОБЛЕМЫ ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБ0ТБ
Глава
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Искусственная эволюция белков
12 Цели и задачи искусственной эволюции белков
13 Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза
14 Радиационный и химический мутагенез
15 Метод подверженной ошибкам НЦР
16 Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза
17 Сайт-специфический мутагенез
18 Сайт-сосредоточенный мутагенез
19 Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами
110 Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза
111 Метод перетасовки ДНК
112 Метод геномной перетасовки
113 Метод прерывистой элонгации
114 Случайное образование химерных молекул на временной матрице
115 Гетеродуплекс
116 Сборка соответствующих олигонуклеотидов
117 Мутагенная и однонаправленная повторная сборка
118 Метод экзонной перетасовки
119 Негомологичная рекомбинация
120 Аллостерические ферменты
121 Аллостерическая регуляция
122 Ретроингибирование
123 N-ацетилглутамат-синтетаза
124 N-ацетилглутамат киназа
125 Карбамоилфосфат синтетаза
126 Механизм действия CPSase
127 Аллостерическая регуляция CPSase
128 Регуляция траискрипции оперона сагАВ
Глава
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Бактериальные штаммы
22 Конструирование штамма B7::argA-ml3::argGH
23 Среды и условия культивирования штаммов
24 Условия культивирования штаммов TG1, В16-4, В3083 и В
25 Условия культивирования штаммов-нродуцентов оротовой кислоты и аргинина
26 Эксперименты с рекомбинантной Д1Ж
27 Генно-инженерные методики
28 Конструирование цлaзмидыpUC18-argI
29 Конструирование нлазмидырКК-argA-wt
210 Конструирование нлазмиды pMIV-5-Pi-argA-ml
211 Конструирование плaзмидыpMIV-5-Pi-argGH
212 Конструирование нлазмиды pET-Piac
213 Конструирование нлазмиды pEL-carAB-wt
214 Конструирование малокоцийных цлазмид, содержаш;их гены сагАВ
215 Создание библиотек мутантных генов
216 Создание библиотеки мутантных argA генов
217 Создание библиотеки мутантньгх сагВ генов
218 Отбор активных мутантов
219 Отбор вариантов, синтезируюш;их активную NAGS в клетках Е соИ штамма TG
220 Отбор вариантов, синтезируюш;их активную NAGS в клетках ЕсоИ В
221 Отбор вариантов, синтезируюш;их активную CPSase
222 Выделение и очистка белка NAGS
223 Измерение ферментативных активностей
224 Анализ ферментативной активности мутантных NAGS
225 Анализ ферментативной активности мутантньгх CPSase
Глава
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Метод комбинаторного мутагенеза
32 Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы
33 Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA
34 Селекция "активных вариантов" мутантных ферментов NAGS в клетках ЕсоИ штамма TG
35 Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках Ecoli штамма В
36 Активности мутантных ферментов в клеточньгх экстрактах
37 Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS
38 Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штаммапродуцента аргинина
39 Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е соИ
310 Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ
311 Селекция fbr мутантов CPSase
312 Применение нолученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты
313 Применение полученных fbr-мутантов CPSase в нроцессе конструирования штамма-нродуцента аргинина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение:
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время аминокислоты приобрели огромное промышленное значение. Область их нрименения необычайно широка, от использования в качестве компонентов пиш;евых добавок до создания на их основе лекарственных форм и разнообразной косметики. Современное нроизводство аминокислот исчисляется миллионами тонн в год, а совокупный объем продаж миллиардами долларов. Очевидно, что стремительно развиваюп];ийся рынок аминокислот и продуктов, созданньж на их основе будет требовать адекватного увеличения их производства (Bongaerts et ah, 2001). На сегодняшний день практически безальтернативным способом массового производства большинства аминокислот является их микробный синтез. Эффективность этого биотехнологического нроцесса во многом зависит от характеристик используемого бактериального штамма-продуцента. множество задач, В процессе его конструирования необходимо связанных с различными сторонами решать жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести оптимизацию экспрессии генов биосинтеза целевой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза, повышение эффективности транснорта в клетку питательньгх веществ и экспорта целевой аминокислоты в культуральную жидкость, и т.д. Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммовпродуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных снособов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Этот процесс основан на нринципе отрицательной обратной связи, когда продукт биосинтетической цени подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию. Как правило, подобной регуляции подвержены ферменты, катализирующие нрактически необратимые биохимические реакции. Перераспределяя потоки ключевых молекул между клеточным метаболизмом и синтезом данного вещества (например аминокислоты или нуклеотидов) в зависимости от его концентрации, эти белки вынолняют функцию своеобразных "метаболических клапанов", обеспечивающих клеточный гомеостаз. Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных белков, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено {fbr, feed back resistance фенотин). Как нравило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности. Поиск и идентификация fbr трудоемкой задачей. Эти мутации мутантов обычно всегда являлось достаточно при возникают спонтанно благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора {Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и соавт., 1988; Di Girolamo et al, 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводить те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов и полученные таким образом мутанты имеют существенно более низкую удельную активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT, Nakamori et al, 1998; мутантов пантотенат киназы, i?ocA:e? о/., 2003; мутантов префенат дегидротазы, ЯУМ е о/., 2004). Таким образом, получение ферментов со снятым ретроингибированием и одновременным сохранением его основных кинетических параметров во многом определяется экспериментальным везением. В этой связи, весьма актуальной представляется задача разработки новых методологических подходов к проблеме получения модифицированных аллостерических ферментов с заданными функциональными нараметрами. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ Целью данной работы являлись разработка метода комбинаторного мутагенеза и его применение для модификации аллостерической регуляции Nацетилглутамат синтетазы (NAGS) и карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) из Е. coli. В ходе работы были решены следующие задачи: разработка метода эффективного направленного мутагенеза, позволяющего получать "библиотеку" мутантных генов, кодирующих белки, которые различаются по нескольким аминокислотам в одном заданном участке аминокислотной носледовательности; получение fbr мутантов NAGS, обладающих высоким уровнем удельной активности и исследование их основных кинетическргх параметров; получение fbr мутантов CPSase, нечувствительных к ингибированию иМР и обладающих высоким уровнем удельной активности; применение модифицированных ферментов в процессе создания штаммов-продуцентов аргинина и оротовой кислоты на основе Е. coli. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Разработана мутагенеза библиотеку (метод генов, оригинальная методика эффективного направленного получать белков, комбинаторного кодирующих мутагенеза), позволяющего выборку представительную различающихся по нескольким аминокислотам в одном специфическом участке. Впервые была показана возможность применения данного метода для получения не подверженных ретроингибированию ферментов: NAGS и CPSase из Е. coli. В каждом случае из совокупности мутантных белков удалось отобрать ферменты с заданными свойствами без иснользования специальных методов селекции. На примере NAGS показано, что предложенный подход позволяет получать серию мутантов с измененными в широком диапазоне основными кинетическими параметрами ферментов (Км, Утях)- Полученная коллекция мутантных белков может быть использована для дальнейших экспериментов по изучению их структуры и функций. Внервые показано, что представленная методика может быть эффективно использована при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот (нуклеотидов) на этапе оптимизации экспрессии генов аллостерических ферментов, что нашло отражение в соответствующем патенте.
|
